冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  冰凍切片組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過(guò)熒光染料甲酚紫標記的多肽底物作為探針，自由進(jìn)入細胞內，受到組織蛋白酶B水解后，呈現熒光現象，以分析樣品酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種冰凍組織內組織蛋白酶B的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，活體檢測，操作簡(jiǎn)易，性能穩定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類(lèi)半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細胞器內，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標蛋白。根據其結構和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細胞內蛋白和細胞外蛋白通過(guò)內吞進(jìn)行周轉中起著(zhù)重要作用，同時(shí)也是啟動(dòng)和傳遞細胞凋亡信號的替代機制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱(chēng)為CTSB，作為溶酶體的標志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉移、骨再吸收、細胞內或分泌性調節蛋白周轉、卵細胞成熟、細胞凋亡等方面具有重要作用。細胞間接觸和細胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應。組織蛋白酶B異常，將導致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。使用熒光標記的特異性底物可以探測組織蛋白酶B的特異活性。熒光染料甲酚紫（cresyl violet）上基團，通過(guò)酰胺（amide linkage）與人工合成的二肽化合物組織蛋白酶B底物RR（Arg-Arg；精氨酰精氨酰）雙重替換后，受到組織蛋白酶B的水解后，釋放出具有紅色熒光的單一基團替換或無(wú)替換的甲酚紫，以此進(jìn)行熒光（激發(fā)波長(cháng)510至560nm，散發(fā)波長(cháng)570至620nm波長(cháng)）檢測組織蛋白酶B的活性。

產(chǎn)品內容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀釋液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)               1份

保存方式

保存  染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細胞熒光定性分析

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent B）室溫下預熱。然后移出xx微升  染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent B），混勻后，室溫下靜置，并標記為  染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準備2片待測的厚為10微米的未經(jīng)固著(zhù)處理的冰凍切片（注意：建議使用異戊烷快速冷凍制片）

2． 置于室溫下，小心加上xx微升預冷的  清理液（Reagent C），鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面

3． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

4． 小心加上xx微升室溫預熱的含有  染色液（Reagent A） 和  稀釋液（Reagent B）的  染色工作液，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面

5． 在37℃濕潤培養箱里，孵育30至60分鐘（注意：避免液體蒸發(fā)；可以蓋上蓋玻片孵育）

6． 小心移去切片上的  染色工作液，避免光照

7． 小心加上xx微升  清理液（Reagent C），鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent C）

9． 放上蓋玻片或封片

10． 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察 ：濾波器激發(fā)波長(cháng)550nm，散發(fā)波長(cháng)610nm ――如果紅色熒光強度顯著(zhù)增強，表明組織蛋白酶B活性增強

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（0.1毫升工作液）操作

2． 所有操作均須無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 建議使用正常組織切片作為陰性對照，顯示微弱的背景信號

5． 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析

6． 用戶(hù)可以使用510至560nm激發(fā)波長(cháng)和570至620nm散發(fā)波長(cháng)的任一波長(cháng)進(jìn)行檢測

7． 用戶(hù)可以使用赫斯特33342（Hoechst33342）進(jìn)行復染，終濃度為1微克/毫升

8． 孵育時(shí)，必須避免光照

9． 本公司提供系列組織蛋白酶熒光染色分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰