DNA損傷測試盒中文版說(shuō)明書(shū)

（貨號：MB1189  彗星法）

一、測定意義：

DNA在自由基（如·OH）的攻擊下容易發(fā)生損傷，即脫氧戊糖遭到破環(huán)，磷酸二脂鍵的斷裂，堿基的破環(huán)或脫落，便可進(jìn)一步產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。將細胞固定于低熔點(diǎn)瓊脂糖中，取少量細胞涂在載玻片上，用堿高鹽溶液破壞細胞膜，再用堿溶液使DNA分子解旋。將載玻片置于電泳液中，在電場(chǎng)的作用下，DNA分子向陽(yáng)極移動(dòng)。如果DNA損傷嚴重，碎片多，則電泳速度快。未受損傷的DNA大分子則由于細胞膜的阻隔，滯留在原處。用PI染色或銀染，可觀(guān)察到DNA受損的細胞形同彗星現象，作定性分析。也可用相關(guān)的軟件作定量分析。

二、試劑盒組份：

三、所需儀器及自備試劑：

低速離心機、水平電泳儀、熒光顯微鏡、37℃和45℃恒溫水浴箱、載玻片、蓋玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液、PBS

四、注意事項：Propidium Iodide（PI）和EB有毒，操作時(shí)要戴手套。

五、操作步驟：

   1、細胞用冰冷的PBS洗一次，離心收集，用PBS重懸使其密度為1x10⁶個(gè)/ml；

   2、鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用PBS配制，

      第1層凝膠的制備：將載玻片的磨砂面向上，45℃預熱，將預熱45℃的100μl的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖（NMA）鋪于載玻片上，蓋上干凈的蓋玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。

第2層凝膠的制備：將10μl細胞（約10⁴個(gè)）和75μl的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA（在37℃下水浴加熱至少20min使之*溶化）混合均勻。然后，輕輕揭去蓋玻片，迅速將含細胞的LMA滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片，置4℃10min使第2層LMA凝固。

第3層凝膠的制備：第2層LMA凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片，滴加預熱37℃的75μl的0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖LMA，如上蓋上蓋玻片4℃下凝固（第三層覆蓋第二層周?chē)?.5mm,增加凝膠化作用時(shí)間至30min，高濕度環(huán)境）。

3、細胞裂解：移去蓋玻片，將玻片置于平皿中，倒入預冷的Lysis Bufffer（使用前每9ml加入1ml的DMSO），4℃裂解1～2h，取出載玻片用PBS漂洗。

4、DNA堿解旋：將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液（用戶(hù)自備1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH），約覆過(guò)載玻片膠面0.25cm左右，室溫放置20～60min,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區段，使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。

5、單細胞電泳：在電壓25V，電泳20～30min，電壓、電流可用改變緩沖液面高低來(lái)調節。

6、中和與染色：電泳后將載玻片置于平皿內。加入0.4mmol/L Tris-HCl（ph7.5）緩沖液，將載玻片沒(méi)入，4℃中和三次，每次10min，棄去Tris-HCl緩沖液，每載玻片加20μl的PI染液或EB染液，蓋上蓋玻片，避光染色10min。

7、觀(guān)察、拍照和分析：熒光顯微鏡515～560nm波長(cháng)的激發(fā)光、PI染色的DNA圖象呈紅色，EB染色的DNA圖象呈桔紅色，可清楚地觀(guān)察到核DNA和遷移的DNA（即慧星尾）。每個(gè)樣本隨機選擇100個(gè)細胞，測定核DNA直徑和DNA遷移的長(cháng)度，可并用相應的軟件分析。

DNA損傷按慧星尾部DNA量占全部DNA量的比例分為5級：

0級：        ＜ 5%             無(wú)損傷；

1級：       5 ～20%          輕度損傷；

2級：       20～40%          中度損傷；

3級：       40～95%          高度損傷；

4級：       ＞ 95%           重度損傷。