細菌的不同顯色反應是由于細胞壁對乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結構決定的。經(jīng)結晶紫染色的細胞用碘液處理后形成不溶性復合物，乙醇能使它脫色。在革蘭陰性細胞染色中，乙醇或丙酮破壞了胞壁外膜、損傷肽聚糖層和細胞質(zhì)膜，結晶紫和碘的復合物從細胞中滲漏出來(lái)，當再用其他染色液復染時(shí)，顯現紅色。紅色染料雖然也能進(jìn)入已染成紫色的G+細胞，但被紫色蓋沒(méi)，所以紅色顯示不出來(lái)。在革蘭陽(yáng)性細胞染色中，乙醇還能使厚的肽聚糖層脫水，導致孔隙變小，由于結晶紫和碘的復合物分子太大，不能通過(guò)細胞壁，不易脫色，所以保持著(zhù)紫色。

　　冰凍切片細胞色素C氧化酶活性染色試劑盒操作步驟（僅供參考）：

　　1、涂片：取待檢細菌，于載玻片中央涂成薄層或者或在載玻片上滴加少許無(wú)菌水，取菌與的水混合均勻，涂成一薄層。

　　2、干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥。

　　3、固定：手持載玻片一端，標本面朝上，在酒精燈的火焰外側快速來(lái)回移動(dòng)3~5次，每次1s，溫度不宜過(guò)高，防止菌體蛋白變性，放置待涼后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。

　　4、初染：滴加結晶紫染色液染色1~2min，清水沖洗去染色液。

　　5、媒染：滴加Gram碘液，并覆蓋載玻片，室溫放置1~2min，水洗。

　　6、脫色：滴加脫色液，搖動(dòng)10～30s，直至流下的脫色液不出現紫色時(shí)為止，立即用水沖去脫色液，終止反應。

　　7、復染：滴加沙黃染色液染色30s~1min，水洗。

　　8、干燥。

　　9、鏡檢：置油鏡觀(guān)察。

　　冰凍切片細胞色素C氧化酶活性染色試劑盒注意事項：

　　1、涂片之前，應事先在背面做好圓圈標記，以便判斷后續試驗的位置。

　　2、取細菌時(shí)，應注意自我防護，拔或塞試管塞時(shí)，應將試管口通過(guò)火焰略加燒灼，zui后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

　　3、加熱固定涂片時(shí)，應注意玻片勿太靠近火焰，一般要求玻片溫度不超過(guò)60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺(jué)過(guò)燙為宜。

　　4、革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴格掌握脫色程度，脫色時(shí)間應根據經(jīng)驗判斷。脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；脫色不夠，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。

　　5、待檢細菌培養時(shí)間也會(huì )影響染色效果，陽(yáng)性菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)或已死亡或細菌溶解，都常呈陰性反應。

　　6、上述試劑均對人體有刺激性，請注意適當防護。