真菌/酵母細胞內氧化應激活性氧初級熒光測定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 真菌/酵母細胞內氧化應激活性氧初級熒光測定試劑是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在細胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來(lái)定量檢測細胞內活性氧族的生成和增加的*而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種實(shí)驗用真菌/酵母菌株細胞內氧化應激活性氧的分析?？梢员挥糜诩毎蛲?、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測，性能穩定，熒光清晰。

技術(shù)背景

真菌/酵母細胞是一種低等單細胞真核生物，具有細胞生長(cháng)快，易于培養，遺傳操作簡(jiǎn)單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達調控機制和表達產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認識最早，最先作為外源基因表達的細胞宿主。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過(guò)細胞膜的染色劑。一旦被過(guò)氧化氫、過(guò)氧化基、過(guò)氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據此測定細胞內活性氧族的濃度。據此測定細胞內活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A）           毫升

 染色液（Reagent B）           微升

 稀釋液（Reagent C）           毫升

 溶解液（Reagent D）           毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)             1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀(guān)察

微型臺式離心機：用于沉淀真菌/酵母細胞

培養箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿：用于熒光定量分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

熒光分光光度儀：用于細胞熒光定量分析

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  稀釋液（Reagent C），混勻后，標記為  染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細胞/毫升）

2． 移入到1.5毫升離心管

3． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心抽掉上清液

5． 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A），混勻

6． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

7． 小心抽掉上清液

8． 重復實(shí)驗步驟5至7一次

9． 加入xx毫升含有  染色液（Reagent B）和  稀釋液（Reagent C）的  染色工作液，混勻（注意：參見(jiàn)注意事項7）

10． 放進(jìn)28℃培養箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照

11． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心抽掉上清液

13． 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A），混勻

14． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心抽掉上清液

16． 加入xx微升預冷的  清理液（Reagent A），混勻

17． 放進(jìn)冰槽里

18． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

a) 即刻進(jìn)行細胞流式儀分析：波長(cháng)488nm氬離子激光，觀(guān)察50000個(gè)細胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀(guān)察（定性檢測）：

1）移取5微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)530nm――

綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高

c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升  溶解液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數次

4）室溫下，靜置15分鐘，避免光照

5）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(cháng)490nm，散發(fā)波長(cháng)530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 操作時(shí)，避免污染母液

4． 建議染色*后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析

5． 孵育時(shí)，必須避免光照

6． 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久

7． 根據不同菌株類(lèi)型，可以調整  染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過(guò)度染色

8． 本公司提供陽(yáng)性對照甲萘醌溶液（ 12041），觀(guān)察細胞熒光增強現象

9． 本公司同時(shí)提供  真菌/酵母細胞細胞內活性氧高質(zhì)熒光測定試劑盒（ 10016.7），滿(mǎn)足不同用戶(hù)需求

10． 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰