活體細胞線(xiàn)粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 活體細胞線(xiàn)粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑是一種旨在通過(guò)鈣黃綠素－鈷技術(shù)，選擇性地聚集在線(xiàn)粒體內呈現熒光染色，而存在于或由線(xiàn)粒體釋放到細胞漿的熒光染料，即刻發(fā)生熒光淬滅，來(lái)分析和觀(guān)察線(xiàn)粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種活體細胞線(xiàn)粒體（動(dòng)物、人體、昆蟲(chóng)等）膜通道孔活性（瞬時(shí)或長(cháng)期開(kāi)放狀態(tài)）的檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定。

技術(shù)背景

線(xiàn)粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線(xiàn)粒體內外膜成分構成的非特異性且鈣離子依賴(lài)性通道。在細胞凋亡或壞死時(shí)，線(xiàn)粒體內容物通過(guò)膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開(kāi)放，顯著(zhù)改變線(xiàn)粒體的通透性。鈣離子過(guò)度進(jìn)入、線(xiàn)粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導致膜通道孔的持續開(kāi)放，而造成細胞色素C的釋放和線(xiàn)粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱(chēng)雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：*，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結合性；第三，不是線(xiàn)粒體酶的底物；第四，容易進(jìn)入細胞及其線(xiàn)粒體。鈣黃綠素-AM進(jìn)入細胞后，被細胞內酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強的鈣黃綠素。鈣黃綠素進(jìn)入線(xiàn)粒體后，被線(xiàn)粒體俘獲。同時(shí)胞漿內的鈣黃綠素受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線(xiàn)粒體膜通道孔瞬時(shí)開(kāi)放，鈣黃綠素釋放出來(lái)，被鈷離子淬滅。線(xiàn)粒體內鈣黃綠素熒光的變化，表明膜通道孔的開(kāi)放狀態(tài)。

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液（Reagent B） 100微升

 中和液（Reagent C）  10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶(hù)自備

24孔細胞培養板：用于貼壁細胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細胞染色的容器

微型臺式離心機：用于沉淀細胞

培養箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于細胞熒光定量分析

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 中和液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預熱。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入500微升 中和液（Reagent C），混勻后，標記為 染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 貼壁細胞染色

• 準備1個(gè)細胞培養24孔板的待測細胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和其它培養孔板，見(jiàn)注意事項8）
• 小心抽去細胞培養液
• 小心沿著(zhù)孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到1個(gè)細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著(zhù)孔壁加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液到1個(gè)細胞培養孔，覆蓋培養孔表面
• 放進(jìn)37℃細胞培養箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心沿著(zhù)孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到細胞培養孔
• 小心抽去清理液
• 重復實(shí)驗步驟8和9一次
• 小心沿著(zhù)孔壁加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A）到細胞培養孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察（定性檢測）：

激發(fā)波長(cháng)488nm，散發(fā)波長(cháng)505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：

放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(cháng)488nm，散發(fā)波長(cháng)505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 懸浮細胞或脫離細胞染色

• 將懸浮細胞或脫離細胞（1 X 10⁶細胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細胞培養箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重復實(shí)驗步驟11至13一次
• 加入500微升37℃預熱的 清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 進(jìn)行細胞流式儀分析（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）：波長(cháng)488nm氬離子激光，觀(guān)察50000個(gè)細胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀(guān)察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）

2）激發(fā)波長(cháng)488nm，散發(fā)波長(cháng)505nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升 清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀（每隔5分鐘檢測一次，持續30分鐘）：激發(fā)波長(cháng)488nm，散發(fā)波長(cháng)505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除 染色液（Reagent B）外，需37℃預熱
• 建議細胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產(chǎn)品適合各種規格的培養細胞：載玻片，載玻片培養皿，35mm培養皿，和各種培養孔板，須相應調整處理液：

• 如果不具備505nm散發(fā)波長(cháng)的濾波器，可以使用505nm至530nm中的任一波長(cháng)
• 如果黑色96孔板的背景讀數過(guò)高，可以選擇530nm散發(fā)波長(cháng)
• 如果膜通道孔為瞬時(shí)開(kāi)放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑：  0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，維護熒光完整
• 本公司提供系列線(xiàn)粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰