食物總抗氧化能力（TAC）比色法（FRAP）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

 食物總抗氧化能力（TAC）比色法（FRAP）定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)使用三吡啶基三嗪鐵復合物，在抗氧化劑的存在下，還原產(chǎn)生藍色的亞鐵產(chǎn)物，通過(guò)分光光度儀，觀(guān)察其峰值下降的變化，來(lái)定量檢測對應于標準水溶性生育酚Trolox的總抗氧化能力，即抑制氧化等值濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。適用于各種新鮮食物的總抗氧化能力檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。在生物系統內，通過(guò)抗氧化酶例如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、銅藍蛋白（ceruloplasmin；CER）、鐵蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、類(lèi)胡蘿卜素、抗壞血酸、還原性谷胱甘肽和尿酸膽紅素（bilirubin）等，產(chǎn)生抗氧化能力，即捕獲自由基的能力，達到消除或降低ROS的損害。通過(guò)正鐵還原抗氧化力（ferric reducing antioxidant power；FRAP）檢測，即使用氯化鐵和三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridyltriazine；TPTZ）產(chǎn)生的三吡啶基三嗪鐵復合物（Fe3-TPTZ），受到抗氧化劑作用還原為三吡啶基三嗪亞鐵復合物（Fe2-TPTZ），呈現出藍色，以 衡量體系中消耗抗氧化劑的能力，在分光光度儀（593nm波長(cháng)）的幫助下，觀(guān)察其峰值下降的變化，并與標準化抗氧化劑水溶性生育酚Trolox對照。

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A）     500毫升

 緩沖液（Reagent B）      20毫升

 染色液A（Reagent C）       1毫升

 染色液B（Reagent D）       1毫升

 標準液（Reagent E）     200微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存 染色液A（Reagent C）、 染色液B（Reagent D）和 標準液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 染色液A（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶(hù)自備

50毫升燒杯：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標準樣品配制的容器

4℃臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于孵育反應

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實(shí)驗步驟

• 樣品準備

1、固態(tài)食品處理

• 秤取1克固態(tài)食品或粉末到50毫升燒杯，杯口封口膜密封
• 加入8毫升 清理液（Reagent A）
• 攪拌30分鐘，充分混勻
• 繼續加入 清理液（Reagent A）到終容量為10毫升
• 過(guò)濾紙過(guò)濾，去除不溶性固體顆粒
• 封口膜封口備用

2、液態(tài)食品處理

• 移取5毫升待測液態(tài)食品到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 移取上清液到新的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）可以加入適量的 清理液（Reagent A） 
• （選擇步驟）過(guò)濾紙過(guò)濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈）
• 置于冰槽里備用或放進(jìn)-20冰箱里保存

二、標準液準備

• 準備好5個(gè)1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 移取100微升 標準液（Reagent E）到1號管
• 分別移取50微升 緩沖液（Reagent B）到2至5號管
• 小心移取1號管的 50微升 標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取50微升2號管稀釋的 標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取50微升3號管稀釋的 標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見(jiàn)下表

• 樣品測讀

• 準備1個(gè)96孔板，做好標記：空白對照孔、標準對照孔、樣品孔
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent B）到96孔板里的每個(gè)孔里
• 分別加入20微升 染色液A（Reagent C）
• 分別加入20微升 染色液B（Reagent D）
• 加入10微升 緩沖液（Reagent B）到空白對照孔里
• 加入10微升上述配制的 標準液（Reagent E）到相應標準對照孔里
• 加入10微升細胞裂解樣品（100微克蛋白總量）到樣品孔里
• 震動(dòng)96孔板，使其混勻
• 在37℃培養箱里孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標儀里測讀：593nm波長(cháng)
• 分析結果：
  • 構建標準曲線(xiàn)：縱座標（Y軸）為吸光單位（OD593nm）；橫座標（X軸）為標準Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 空白對照孔為zui大吸光單位（OD593nm）讀數
  • 標準對照孔和樣品孔為實(shí)際吸光單位（OD593nm）讀數
  • 根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）
  • 計算樣品實(shí)際總抗氧化能力

【根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應Trolox濃度（微摩爾/升）X 0.25（體系容量；毫升） X 樣品稀釋倍數】÷0.01（樣品容量；毫升）＝（微摩爾/升TROLOX等值）

• 根據下列公式計算測定體系中樣品量的總抗氧化能力（實(shí)際抑制百分率）

【（空白對照孔吸光單位讀數－實(shí)際吸光單位讀數）÷空白對照孔吸光單位讀數】X100％

• IC50：50％抑制率所需的樣品單位：TROLOX等值或樣品蛋白濃度（毫克/毫升）或樣品容量（微升）

  X（所需樣品單位）＝（已知樣品單位÷實(shí)際抑制百分率）X 50％

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 本產(chǎn)品測試范圍為25至800微摩爾
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品制備的所有操作均須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行
• 測試前，樣品須新鮮收集
• 樣品須清澈
• 樣品避免含有Tris、EDTA和還原劑等
• 樣品讀數越低，抗氧化能力越高
• 樣本量不宜超過(guò)20微升
• 可以使用比色皿檢測
• 如果樣品抗氧化劑濃度過(guò)高或過(guò)低， 建議稀釋或增加樣品濃度
• 如果測試樣品很多，建議使用排槍移液
• 本公司提供系列抗氧化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感