純化線(xiàn)粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 純化線(xiàn)粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)極譜法檢測系統（polarographic system）測定新鮮活體線(xiàn)粒體在A(yíng)DP存在（III態(tài)呼吸）與否（IV態(tài)呼吸）的情況下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差異，即呼吸控制率（RCR），以評價(jià)線(xiàn)粒體結構和功能完整性以及氧化磷酸化效率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。可以被用于線(xiàn)粒體生理功能和藥物作用機制等的研究。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測，性能穩定。

技術(shù)背景

線(xiàn)粒體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過(guò)質(zhì)子梯度偶聯(lián)成一體。線(xiàn)粒體結構完整，功能正常，底物充分，電子傳遞形成的質(zhì)子梯度不斷被消耗，電子得以順暢傳遞，氧氣快速消耗，其耗氧率大，為III態(tài)呼吸。ADP耗竭，質(zhì)子梯度不能消耗，阻礙電子傳遞，氧氣消耗減少，為IV態(tài)呼吸。 呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又稱(chēng)呼吸調節比，是指III態(tài)（加入ADP）的呼吸速率與IV態(tài)（ADP耗竭）的呼吸速率之比。正常線(xiàn)粒體的RCR為3至10：RCR降低意味著(zhù)線(xiàn)粒體ATP合成功能損傷，呼吸障礙；RCR增高意味著(zhù)細胞活動(dòng)旺盛，代謝加快。

產(chǎn)品內容

 介質(zhì)液（Reagent A）      50毫升

  IV態(tài)底物液（Reagent B）     400微升

  III態(tài)底物液（Reagent C）     400微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

CLARK氧電極儀：用于測定溶解氧濃度

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開(kāi)始前，制備好新鮮的線(xiàn)粒體置于冰槽里備用；同時(shí)將－20℃冰箱里的試劑融化，并預熱氧電極儀到25℃。然后進(jìn)行下列操作。

• 加入2.5毫升 介質(zhì)液（Reagent A）到反應玻璃槽
• 使用微型磁力子攪拌，充分混勻
• 密封反應槽
• 開(kāi)始記錄氧濃度：起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升（25℃）
• 持續記錄1分鐘后，注射加入20微升待測的線(xiàn)粒體（總量2毫克）（注意：氧濃度可能瞬時(shí)變化）
• 持續記錄1分鐘后，注射加入20微升  IV態(tài)底物液（Reagent B）――開(kāi)始IV態(tài)呼吸（注意：參見(jiàn)注意事項9）
• 持續記錄2分鐘：出現氧濃度緩慢下降
• 繼續注射加入20微升  III態(tài)底物液（Reagent C）（注意：氧濃度在10秒鐘內開(kāi)始下滑）――開(kāi)始III態(tài)呼吸（注意：參見(jiàn)注意事項9）
• 持續記錄直至出現線(xiàn)性下行斜線(xiàn)出現拐點(diǎn)
• 分別測算III態(tài)呼吸速率和IV態(tài)呼吸速率：氧濃度降低值÷實(shí)際時(shí)間（分鐘）
• 計算呼吸控制率：III態(tài)呼吸速率÷IV態(tài)呼吸速率

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 確保反應玻璃槽潔凈，密閉，以免氧氣流入
• 線(xiàn)粒體樣品須新鮮制備，建議不要凍存；制備的線(xiàn)粒體膜須完整，非常重要；建議使用 線(xiàn)粒體分離試劑盒－GMS10006.1
• 注射加入反應槽時(shí)，避免氣泡和空氣注入
• 避免乙醇污染；乙醇增加氧濃度；如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解，則加注10微升
• 保持反應槽溫度恒定，溫度降低，氧濃度升高
• 反應液充分混勻，和環(huán)境氧保持平衡
• 加注  IV態(tài)底物液（Reagent B）和  III態(tài)底物液（Reagent C）前，須充分凍融和混勻
• 嚴格按照規定加注試劑，切莫增加加注試劑容量
• 本公司提供系列線(xiàn)粒體檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感