細胞/組織溶酶體粗提分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

  細胞/組織溶酶體粗提分離試劑是一種旨在從動(dòng)物細胞或組織中分離出完整而純化的溶酶體細胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和培養細胞的溶酶體的制備。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。

技術(shù)背景

溶酶體（lysosome）是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各種細胞殘渣和廢棄物質(zhì)，包括過(guò)多的或破損的其它細胞器、食物顆粒、吞噬的細菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米，球圓形，溶酶體內pH為5.0左右。溶酶體功能異常會(huì )引起溶酶體貯積癥（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性*?。?/span>Tay-sachs disease）和龐貝氏癥 （Pompe’s disease）。溶酶體細胞器的分離是現代細胞生物學(xué)研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細胞分離溶酶體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過(guò)機械或化學(xué)方法破裂細胞；第二，通過(guò)低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過(guò)高速差速離心獲得溶酶體；甚至，第四，可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

產(chǎn)品內容

  清理液（Reagent A）   毫升

  裂解液（Reagent B）   毫升

  凈化液（Reagent C）   毫升

  強化液（Reagent D）   毫升

  分離液（Reagent E）   毫升

  保存液（Reagent F）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存  凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶(hù)自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（GMS12028）或PBS緩沖溶液（GMS12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離

*細胞培養液（GMS12052）：用于細胞處理所需的培養基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細胞

實(shí)驗步驟

• 動(dòng)物軟組織溶酶體分離（組織勻漿法）

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
• （選擇步驟）放進(jìn)預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見(jiàn)注意事項8）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動(dòng)物軟組織溶酶體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定1克組織重量（實(shí)驗前使動(dòng)物空腹12至24小時(shí)）
• （選擇步驟）放進(jìn)預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升  清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的  強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項9）
• 加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入500微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

三、動(dòng)物細胞溶酶體分離（細胞勻漿法）

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（10⁷），直至細胞生長(cháng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養表面
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實(shí)驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)細胞生長(cháng)表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的*細胞培養液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見(jiàn)注意事項8）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入x微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

四、動(dòng)物細胞溶酶體分離（化學(xué)處理法）

實(shí)驗開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的  凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx毫升  凈化液（Reagent C）和xx毫升的  裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為  裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（10⁸），直至細胞生長(cháng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養表面
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實(shí)驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)細胞生長(cháng)表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶(hù)自備的*細胞培養液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的  裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預冷的  強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項9）
• 加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心10分鐘，速度為12000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入xx毫升預冷的  分離液（Reagent E），混勻
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 放進(jìn)4℃超速離心機離心15分鐘，速度為25000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體沉淀物
• （選擇步驟）加入xx毫升預冷的  保存液（Reagent F）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃超速離心機再次離心15分鐘，速度為25000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入xx微升  保存液（Reagent F），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（1克動(dòng)物組織或 10⁸細胞）操作
• 所有操作均須嚴格在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，須無(wú)菌操作，避免污染母液，尤其是  裂解液（Reagent B）和  分離液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類(lèi)型會(huì )存在差異。用戶(hù)可以通過(guò)顯微鏡觀(guān)察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘（不宜超過(guò)5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類(lèi)型會(huì )存在差異。用戶(hù)可以通過(guò)顯微鏡觀(guān)察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數
• 對于難以裂解的細胞，例如HeLa細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常1克動(dòng)物組織或 10⁸細胞的溶酶體含量為300微克左右溶酶體蛋白

11． 如果需要獲得99％以上純度的溶酶體，使用  細胞/組織高質(zhì)純化溶酶體分離試劑盒－GMS10118.3 

• 溶酶體標志酶活性測定，建議使用  通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性比色法定量檢測試劑盒—GMS70031.1和  純化溶酶體酸性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒—GMS50318.3 
• 溶酶體形態(tài)和功能染色，建議使用  細胞溶酶體形態(tài)染色試劑盒—GMS10121和  純化溶酶體功能中性紅檢測試劑盒—GMS10323 
• 本公司提供系列溶酶體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體內外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體維持正?；钚?/span>
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶