精子細胞氧化應激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

 精子細胞氧化應激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)硝基藍四氮唑染料，受到超氧陰離子O₂^-的還原，產(chǎn)生不溶性藍黑色色素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測精子細胞內活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。適用于動(dòng)物和人體精子細胞的活性氧族的檢測。可以被用于細胞凋亡、衰老、代謝和營(yíng)養學(xué)，以及發(fā)育生物學(xué)（男性不育）等的研究。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩定，顯色清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕性關(guān)節炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。其中精子細胞（spermatozoa）對于活性氧較為敏感：低濃度活性氧可以調節正常精子功能、精子獲能、頂體反應、精卵融合等；高濃度活性氧則影響精子細胞的質(zhì)量和功能，因為精子細胞質(zhì)膜含有大量不飽和脂肪酸，胞漿含有少量的祛除活性氧的相關(guān)酶蛋白，由此活性氧容易造成精子質(zhì)膜的流動(dòng)性和DNA完整性受到損害，精子運動(dòng)能力降低，不能參與授精活動(dòng)，zui終導致特發(fā)性不育癥（idiopathic infertility）。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），是一種黃色水溶性硝基替代性芳香族四氮唑化合物，與細胞內超氧陰離子O₂^-反應而被直接還原，產(chǎn)生不溶性甲暨色素，在分光光度儀下（650nm波長(cháng)），呈現吸光峰值的變化。據此定量檢測精子細胞內氧化應激活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A）    500毫升

 染色液（Reagent B）      1瓶

 溶解液（Reagent C）     10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶(hù)自備

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

細胞培養箱：用于精子細胞染色孵育

96孔板：用于比色分析的容器

酶標儀：用于比色分析

實(shí)驗步驟

• 樣品預處理

• 移取2毫升新鮮收集（1小時(shí)內）的精液到2毫升離心管
• 放進(jìn)37℃培養箱孵育20分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升 清理液（Reagent A），混勻精子細胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入適量的 清理液（Reagent A）
• 充分混勻后，在血細胞計數器上進(jìn)行精子細胞計數
• 調整精子細胞數為1 X 10⁷/毫升
• 放進(jìn)37℃培養箱里備用（1小時(shí)內）

• 樣品檢測

實(shí)驗開(kāi)始前，移出10毫升 清理液（Reagent A）到1瓶 染色液（Reagent B）瓶里，混勻后，標記為 染色工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后進(jìn)行下列操作。

• 移取100微升上述預處理的精子細胞到1.5毫升離心管
• 加入100微升 染色工作液，混勻
• 放進(jìn)37℃細胞培養箱里孵育45分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心10分鐘，速度為500g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)微型臺式離心機離心10分鐘，速度為500g
• 小心抽去清理液
• 重復實(shí)驗步驟6至8一次
• 加入100微升 溶解液（Reagent C），混勻

11． 在室溫下，孵育5分鐘

12． 即刻轉移到96孔板

13． 放進(jìn)酶標儀測讀，波長(cháng)為650 nm

• 構建精子細胞內活性氧生成曲線(xiàn)：縱座標（Y軸）為活性氧吸光值（OD）；橫坐標（X軸）為細胞數、時(shí)間點(diǎn)或藥物處理濃度等
• 或計算ROS水平：

（樣品讀數－本底讀數） ÷ 0.1（毫升；樣品容量） ＝吸光單位（OD） / 毫升＝吸光單位（OD）/1 X 10⁷精子細胞 

注意事項

• 本產(chǎn)品為100次（96孔板）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，須避免光照
• 測試前，精子細胞須新鮮收集，1小時(shí)內為*
• 精子細胞懸液制備后即刻測讀，不宜過(guò)夜保存
• 精子細胞懸液須清澈
• 如果需要排除精液白細胞的干擾，建議純化精子細胞： 精子細胞高純分離試劑盒（GMS14003）
• 如果需要區分精液各種成分的活性氧生成情況，建議使用 精漿（seminal plasma）氧化應激活性氧（ROS）NBT比色法定量檢測試劑盒（GMS14007.2）
• 本產(chǎn)品適合凍存的精子細胞檢測
• 如果活性氧濃度過(guò)低，可以延長(cháng)孵育時(shí)間至2小時(shí)
• 本公司提供系列精子細胞分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感