2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

　　3、加標準品和待測樣本：取足夠數量的酶標包被板，固定于框架上，分別設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標準品孔中加入標準品50μL；待測樣本孔中先加入待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。

　　4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

　　5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。

　　6、加酶標工作液：每孔加入酶標工作液50μL，空白對照孔不加。

　　7、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。

　　8、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4次（也可用洗板機按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。

　　9、顯色：每孔先加入顯色劑A液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，平板混勻器混勻30s（或用手輕輕震蕩混勻30s），37℃避光顯色15min。

　　10、終止：取出酶標板，每孔加終止液50μL，終止反應（顏色由藍色立轉黃色）。

　　11、測定：以空白孔調零，在終止后15分鐘內，用450nm波長(cháng)測量各孔的吸光值（OD值）。

　　12、小鼠核因子κB受體活化因子配基試劑盒計算：根據標準品的濃度及對應的OD值，計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程，再根據樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度，也可以使用各種應用軟件來(lái)計算，zui終濃度為實(shí)際測定濃度乘以稀釋倍數。